صور لإنتاج الفراولة بزراعة الأنسجة

خطوات زراعة الأنسجة في الفراولة

لابد من التخير الجيد للنباتات الام التي تنتخب منها الاجزاء التي ستكون نواة انتاج الشتلات



وهذا هو شكل الجزء النباتي المستخدم والمسمى بالـ Xplant (القمة المرستيمية )




وهذه مرحلة متقدمة بعد زراعة الجزء النباتي







ويلي تكوين المجموع الخضري مرحلة التجذير




وبعد ذلك يتم تقسية النبيتات الناتجة ونقلها للبيئة الصناعية تحت نظام محمي لتقسيتها قبل نقلها للمكان المستديم وتزرع فى أصص(كبايات صغيرة) ممتلئة بالرمل و البيتموس بمعدل 1/1 .


برنامج التسميد بعد زارعة الشتلات الناتجة من زراعة الأنسجة:

أولا: توضع الشتلات فى الصوبة تحت أنفاق بلاستيكية وتترك لمدة أسبوع دون تسميد اللهم إلا الرى بمطهر فطرى برشاشات ورزاز خفيف من فوق الغطاء (الأجرل) ويجب الحفاظ على درجة الحرارة تحت النفق حتى 30 درجة لاتزيد حتى لا تحرق الشتلات.

ثانيا: فى الإسبوع الثانى يتم التسميد بمعدل 1/8 جرام/ لتر ماء (N-P-K(19-19-19  وذلك ثلاث مرات أسبوعيا وعندما تكبر الشتلات بعد حوالى ثلاثة أسابيع تزيد الكمية لتصبح 1/4 جرام سماد / لتر ماء ويتم الرش بمطهر فطرى فى ايام عدم التسميد لو هناك حاجة للرى وبعد شهر يتم كشف البلاستيك ثم الأجرل تباعا بالتدريج حتى يكشف الغطاء كاملا وتوالى الشتلات بالرى و التسميد 1/4 جرام لا يزيد حتى تنقل للمرحلة التالية.

وبعد ذلك تنقل الشتلات الى اوعية تحتوي على بيئة صناعيه خفيفة تماثل بيئات المشاتل الصناعية





ثم تنقل الشتلات بعد ذلك الى صوبة انتاج شتلات الاساس





وهذا الشكل يوضح مظهر النباتات عند تعرضها للبرودة وتلون الاوراق باللون القرمزي

إنتاج الفراولة بتكنيك زراعة الأنسجة

 الفراولة من النباتات المعمرة والتي يجدد زراعتها سنويا في مصر أوراقها ثلاثية مركبة والساق عبارة عن تاج تحت سطح التربة وهو متخشب ويخرج منه البراعم التي تعطي اما زهرة لتحمل الثمرة بعد ذلك أو يخرج منها مدادات أو خلفات والصنف البلدي فقط هو الذي يعطي الخلفات وكانت تلك طريقة التكاثر له بتفصيص الخلفات من النبات الأم وزراعتها وحين انخفاض درجة الحرارة تتلون الأوراق باللون القرمزي وتدخل في طور السكون وقد تتساقط أوراقها ونظرا لبعض الصفات السابقة يعاملها البعض على أنها فاكهة .




طريقة الإكثار بزراعة الأنسجة:
يتم فصل البراعم التى تخرج من على منطقة التاج crown فى شهر   سبتمبر حيث موسم زراعة الفراولة وتسمى الساق التى تحمل البراعم بالمدادات كما هو بالشكل حيث يظهر فى نهاية المداد على شكل إنتفاخ (عبارة عن الأوراق التى تحيط بالبرعم ) وتفصل البراعم من الإنتفاخ هذا بالملقط  وتعقم فى محلول كلوركس بتركيز 25% لمدة عشر دقائق ثم  تغسل بماء مقطر معقم لإزالة آثار الكلوركس وذلك داخل كابينة الزراعة (الهود) وتزال الأوراق المتأثرة بالكلوركس بالملقط المعقم والمشرط وتزرع على بيئة الزراعة الخاصة بالفراولة وهى :
MS salts: 4.4g/L أو الأملاح سابقة الذكر فى المدونة الخاصة بتحضير البيئة.
 الهرمونات:1مل بنزيل لكل لتر بيئة إكثار 
أما التجذير : 1مل إندول أسيتك أسيد لكل لتر بيئة مع 0.5 مل جبريلك أسيد
تحضن النباتات المنزرعة فى غرفة التحضين لمدة شهر على درجة حرارة 27 درجة مئوية.
يتم تجديد البيئة كل 21 يوم بعد الشهر الأول لإزالة الأوراق القديمة وتجديد مساحة سطح الإمتصاص.
تحدث تغييرات للبراعم المنزرعة حيث تنتفخ البراعم وبعد عديد من مرات الزراعة تخرج البراعم الجانيبية وتنقل حوالى أربع مرات فقط من ظهور البراعم الجانيبية حيث تتأثر الفراولة بالهورمونات وتحدث طفرات.
بعد ذلك تأخذ الشتلات المنتجة على الصوبة للأقلمة وسنتكلم عن ذلك إنشاء الله.

تحضير بيئة الزراعة

sTOCK	SALTS	g/L
A	NH4 NO3	82.5
B	K NO3	95
C	K H2 PO4	34
	K I	0.166
	Na2 Mo O4.2H2O	0.05
	H3 BO3	1.24
	Ca CL2.6H2O	0.005
D	Ca CL2.2H2O	88
	Ca CL  أو	66.4
E	Mg SO4.7H2O	74
	Mn SO4.4H2O	4.46
	Zn SO4.7H2O	1.72
	Cu SO4.5H2O	0.005
F	Na2. edta	3.72
	Fe SO4.7H2O	2.7

تحضير الفيتامينات
نيكوتنيك اسيد      5  ملجم / 100 ملى ماء 
البيرودكسين        5 ملجم /  100 ملى ماء 
الثيامين              1 ملجم /  100ملى ماء
الجليسين            20 ملجم / 100ملى ماء
يتم خلط التركيبة السابقة من الفيتامينات وعمل STOCK

تحضير البيئة:
يتم سحب الكميات التالية بالماصة:
A:  يتم سحب 20 ملى / لتر بيئة
B:  يتم سحب 20 ملى / لتر بيئة
C: يتم سحب   5 ملى / لتر بيئة
D:  يتم سحب   5 ملى / لتر بيئة
E:  يتم سحب   5 ملى / لتر بيئة
F:  يتم سحب   10 ملى / لتر بيئة


يتم سحب 10 ملى من STOCK الفيتامينات/ لتر بيئة


الآجار : 7 جم / لتر بيئة
السكر:   30 جم / لتر بيئة
الكازين:  1 جم / لتر بيئة
الإينوزيتول: 0.1 جم / لتر بيئة

يتم طبخ الاجار على النار حتى يندمج مع الماء ويصبح خليط واحد ثم تذاب باقى التركيبة مع بعضها فى اناء واحد ثم تضاف على الاجار المطبوخ ثم تصب فى البرطمانات أو الأنابيب

تضاف الهرمونات حسب النبات المراد إكثاره وسنتحدث عن ذلك مع كل محصول.

فوائد استخدام زراعة الكالوس :-
أ - يعتبر الكالوس مصدر للاختلافات الوراثية الكروموسومية التي تزيد بزيادة عمر مزرعة الكالوس .
ب - انتخاب نباتات مقاومة للملوحة بتعريض الكالوس إلي المؤثرات المختلفة .
جـ - الحصول علي نباتات خالية من الفيرس .
د - استخلاص بعض المواد الخاصة بصناعة الأدوية أو الصناعات الغذائية كمستخلص نبات الفلفل الأخضر .
هـ - يستخدم في الإكثار الخضري السريع للنباتات المنتخبة حيث أن زراعة الكالوس يعطي عدد كبير من النباتات في وقت قصير .
ما يراعي عند إنتاج الكالوس :-
1 - مراعاة الدقة عند استخدام الجزء النباتي المستخدم .
2 - توفير البيئة المناسبة والظروف البيئية المناسبة لزراعة الكالوس .
3 - مراعاة الدقة في عزل والمحافظة علي الكالوس للتجارب الأخرى .
6- زراعة الخلايا :- Cell culture :-
هي عبارة عن زراعة الخلية في معلق الخلايا علي بيئة مناسبة في طبق بتري وتنمية هذه الخلية .
7 - إنصهار أو إندماج البروتوبلاست :- Protoplast fusion
وذلك يفيد في إنتاج هجين من خلال التهجينات بين الأنواع النباتية البعيدة وراثياً أي لا يتم بينها تلقيح وإخصاب في الطبيعة ويسمي الهجين الناتج ( Vegetative hybrids ) , ( Somatic hybrids ) , ( Cybrides ) ويتم ذلك بنزع الجدر السليلوزية .
8 - نقل الجينات :- Gene Transf
عبارة عن نقل جين حامل لصفة معينة في السلسلة الكروموسومية إلي نبات آخر ممتاز في صفاته ولكن ينقصه هذه الصفة ويتم ذلك من خلال الهندسة الوراثية حيث يتم نقل جين من كائن حي إلي كائن حي آخر وتعتبر هذه العملية سلاح ذو حدين .
9 - Somaclonal variation
يقصد به الاختلافات الموجودة ببعض النباتات النامية من خلايا جسمية علي بيئات زراعة الأنسجة .
10 - زراعة الأجنة :- Embryo culture
زراعة الأجنة تفيد في الحالات التي يفشل فيها الجين في الإنبات والنمو وتتم زراعتها علي بيئات مناسبة غذائية لاستكمال نموه وإعطاء نباتات كاملة وحدث ذلك في بعض أصناف الطماطم .
11 - تخليق الأجنة :- Embryo genesis
تفيد في الحالات التي يفشل فيها الإنبات نتيجة عدم تكوين الإندوسبيرم أو الأوراق الفلقية المحتوية علي الغذاء اللازم لنمو الجين .
مثل الهجين الناتج من نبات الراي والشعير حيث وجد أن أجنة هذا الجين لا تستطيع الإنبات والنمو وتم زراعتها علي بيئات غذائية مناسبة وأمكن الحصول منها علي نباتات كاملة .
12 - تخليق الأعضاء النباتية :- Organo genesis
يقصد بها الحصول علي نباتات كاملة مميزة من زراعة خلية أو أي نسيج نباتي آخر , وتفيد في حالة إكثار النباتات التي لا تنتج بذور . وذلك من خلال تنمية أحد الخلايا علي بيئة غذائية مناسبة تحتوي علي التركيز المناسب من الأوكسين والسبتوكاينين بحيث يسمح هذا التركيز بنمو أو تكوين كلاً من المجموع الجذري والمجموع الخضري حيث أن :-
زيادة تركيز السبتوكاينين في البيئة تؤدي إلي تكوين مجموع خضري فقط .
زيادة تركيز الأوكسين في البيئة تؤدي إلي تكوين مجموع جذري فقط .
الخلايا التي لها القدرة علي إعطاء جذور وسييقان تتميز بالآتي :-
1 - السيتوبلازم بها مركز .
2 - كبر حجم حبيبات النشا .
3 - الخلايا بها نواة كبيرة الحجم عن النواة الموجودة في الخلية العادية .
13 - الإخصاب في أنابيب :- in vitro pollination
للتغلب علي مشاكل الإخصاب المتعلقة بوجود عائق في المبسم بوضع البويضات مع حبوب اللقاح .
14 - الحصول علي نباتات خالية من الأمراض :- Apical culture to obtained diseases free plants
الحصول علي نباتات خالية من الفيروسات والأمراض من الأشياء الهامة عند تقييم النباتات قبل عمل التهجينات لمعرفة صفاتها التي قد تختفي نتيجة الإصابة للفيرس أو الأمراض .

المصدر: الموسوعة الزراعية الشاملة الخيرات الزراعية

مزارع الأجنة :- Embryo cultures :-تفيد مزارع الأجنة في التغلب علي مشاكل الإخصاب في التلقيحات البعيدة ويتحكم في نجاح مزارع الأجنة عاملان هما :-
1 - عملية فصل الأجنة الصغيرة
2 - تحديد بيئة الزراعة المناسبة
كما يجب فصل الأجنة قبل أن تبدأ في التدهور والاختفاء كما في حالات الهجن النوعية البعيدة التي يحدث بها عدم توافق بين الجنين النامي والأندوسبيرم , وتحدد مرحلة فصل الجنين المناسبة بعدة أيام من التلقيح .
ونظراً لأن الأجنة تكون محاطة بأنسجة المبيض لذا فإنها لا تكون عرضة للتلوث ولا تحتاج إلي تعقيم ويكتفي بتطهيرها سطحياً .
وعملية فصل الأجنة تحتاج إلي مجهر حتى تتم عملية الفصل بدقة .
ثم تزرع هذه الأنسجة في البيئة المناسبة حتى يكتمل نموها بعد الزراعة ثم تنمو بعد ذلك إلي نباتات صغيرة تنقل بعناية إلي أصص معقمة .
ولقد أمكن زراعة أجنة بعض الهجن النوعية للجنس Brassica حيث تم حصاد مبايض الأزهار الملقحة في الوقت المناسب وتعقم ثم بعد ذلك تقطع طولياً ثم تنقل إلي بيئة مغذية علي جهاز هزاز حيث أدت الحركة الدائمة للبيئة المغذية إلي خروج عدد من الأجنة من مبايض الأزهار .
أهمية مزارع الأجنة :-
1 - إمكانية الحصول علي الهجن البعيدة التي يستحيل الحصول عليها أو إنتاجها بالطرق العادية مثل هجن أجناس الفاصوليا , الكرنب , الطماطم .
2 - إنتاج النباتات الأحادية بسبب الاستبعاد الكروموسومى الذي يحدث أحياناً بعد التهجينات البعيدة , ثم يقوم المربي بمضاعفة الكولوشيسين فيتجمع لديه عدد كبير من النباتات الأصلية المختلفة وراثياً وبالتالي يمكن الانتخاب لأفضلها ليصبح صنف جديد .
3 - تقصير دورة التربية وذلك بالتخلص من حالات سكون البذرة التي قد تمدد إلي شهور .
4 - إكثار بعض النباتات التي لا تنبت بذورها .
مزارع البروتوبلاست :- Protoplast culture :-
تعرف مزارع البروتوبلاست علي انها زراعة الخلايا بدون جدرها الخلوية.
تفيد مزارع البروتوبلازم في عملية دمج البروتوبلازم Protoplasm fusion عند الرغبة في إجراء تهجينات نوعية بعيدة وكذلك عملية إدخال أجزاء غريبة من DNA أو بكتريا أو فيروسات معينة في الهندسة الوراثية حيث يتم عزل البروتوبلازم عن الجدر الخلوية ويزرع في بيئة مناسبة ويتم هذا بواسطة أنزيم السليوليز الذي يحفز من مزارع الفطر .
تعد الأوراق الحديثة التكوين أفضل مصادر الخلايا لمزارع البروتوبلازم حيث يطهر النسيج النباتي المستعمل سطحياً ثم تسلخ بشرة الورقة أو يقطع الجزء النباتي إلي أجزاء صغيرة ويوضع في محلول الأنزيمات ويفضل أن تكون المعاملة بالأنزيمات الهاضمة تحت تفريغ لإسراع عملية تخلل الأنزيمات بين الخلايا وتستمر المعاملة بالأنزيمات 1/2 ساعة إلي ساعة . ثم تزرع علي البيئة الملائمة ويفضل أن تكون سائلة وتظهر الجدر السيليوزية حول البروتوبلازت بعد 2 - 14 يوم . ونجحت هذه الطريقة في العائلة الباذنجانية كالفلفل - الباذنجان - البطاطس .
أهمية مزارع البروتوبلازم :-
1 - يمكن الاستفادة منها في الإكثار وعزل السلالات الفطرية .
2 - دمج بروتوبلازم الأنواع النباتية البعيدة عن بعضها وهوو يعد وسيلة فعالة لإجراء التهجينات البعيدة .
3 - إدخال صفة العقم الذكري السيتوبلازمي في النباتات .
4 - الحصول علي نباتات وراثية يمكن الاستفادة منها في تحسين النباتات وخاصاً العقيمة منها .
5 - إدخال أجزاء من DNA أو البكتريا أو الفيروسات في الهندسة الوراثية .
تعريف البروتوبلاست :-
هو عبارة عن خلايا منزوعة الجدر السليوزية إما عن طريق الأنزيمات ( Cellulase ) أو بطرق أخرى .
مزارع القمة الخضرية المرستيمية :-
يستفاد منها في إنتاج نباتات خالية من الفيرس ويعد ذلك أمر بالغ الأهمية في المحاصيل خضرية التكاثر والتي ينتقل فيها الفيروس تلقائياً مع الأجزاء الخضرية المستخدمة في التكاثر .
وبالرغم من أن النباتات قد تكون مصابة جهازياً بالفيروس إلا أن القمة المرستيمية تكون خالية غالباً أو تحتوي علي عدد قليل جداً من الفيروسات وذلك للأسباب التالية :-
1 - خلو القمة المرستيمية من الأنسجة الوعائية التي يكون انتقال الفيرس فيها سريع .
2 - يكون النشاط الأيضي في القمة المرستيمية غالباً بدرجة يقل معها تكاثر الفيرس .
3 - نظم المقاومة لتكاثر الفيرس تكون أعلي في الأنسجة المرستيمية عنن أي نسيج آخر .
4 - التركيز العالي للأوكسين في القمم النامية يثبط نشاط الفيرس .
ولهذه الأسباب فإن زراعة القمم المرستيمية تؤدي إلي إنتاج نباتات خالية من الفيرس .
ويكون طول القمة المرستيمية 250 ميكرون وعرضها 100 ميكرون ولصعوبة فصل هذه القمة فإنه تستعمل القمة النامية كلها .
ويطلق علي المزارع في هذه الحالة shoot Tip Culture
وتعطي هذه المزارع أيضاً نباتات خالية من الفيرس في أغلب الأحيان .
والذي يحدد مستويات النجاح في هذه العملية هي الدقة في فصل القمة النامية بدون الأضرار بها وكذلك في اختيار البيئة المناسبة للزراعة التي يجب أن تكون محفزة لتكوين الجذور والأوراق من القمم المزروعة .
ملحوظة :-
البيئة الصلبة تشجع تكوين الكالوس وهو أمر غير مرغوب في هذه المزارع ويجب ملاحظة أنه كلما زاد حجم القمة المرستيمية كلما زادت فرصة تمييز نباتات منها أما القمة المرستيمية الصغيرة فإنها تنتهي بتكوين بذور وكالوس فقط وقد لا تتكون جذور .
وعلي ذلك فالقاعدة العامة هي أن تكون القمم المرستيمية صغيرة بحيث تكون نباتات خالية من الفيروس وكبيرة بحيث تسمح بإعطاء نباتات كاملة
من ضمن فوائد زراعة القمة النامية ( القمة الخضرية ) Apical . M . T . C
الإكثار الخضري السريع للنباتات الممتازة لإجراء التجارب عليها أو بيعها في الأسواق .
مزارع الإكثار الدقيق :-
يستفاد من مزارع الإكثار الدقيق في إنتاج سلالات خضرية تحتوي علي عشرات الآلاف من النباتات الصغيرة خلال فترة وجيزة .
ويفضل دائماً استخدام القمة المرستيمية لأنها تكون خالية من الفيرس كما يجب استخدام أجزاء صغيرة من ساق النبات تحتوي كل منها علي عقد وبرعم جانبي وذلك كلأن البراعم الجانبية المفصولة من الأشجار لا تنمو بمفردها لذلك فإن النسيج الأمي الموجود معه يساعده علي النمو . كما أن البراعم الجانبية تتحمل التعقيم عن البراعم الطرفية .
ويحدث الإكثار الدقيق في المزارع بواحدة من ثلاث طرق :-
1 - من خلال الكالس :-
متعد هذه الطريقة من أسرع طرق الإكثار الدقيق إلا أن هذه الطريقة غير مفضلة للأسباب التالية :-
أ - لأن الكالس غير ثابت وراثياً حيث تظهر به حالات مختلفة من التضاعف الكروموسومي .
ب - لم يتميز الكالس إلي نموات نباتية في العديد من المحاصيل الهامة .
2 - من خلال تكوين البراعم العرضية :-
يقصد بالبراعم العرضية تلك البراعم التي تتكون مباشرة من العضو النباتي دون أن يفصل بينها نسيج كالوس .
وتتكاثر أعداد كبيرة من المحاصيل الاقتصادية بهذه الطريقة .
3 - من خلال تحفيز التفرع الجانبي :-
يتم تحفيز التفرع الجانبي في المزارع بتوفير السيتوكينين بها بتركيز معين إما مع الأكسين أو بدونه حيث يؤدي توافر السيتوكينين بالمزرعة إلي نمو البراعم الجانبية التي تكون في القمم المرستيمية التي تنمو من البراعم المزروعة ثم تنمو البراعم الجانبية التي تكون في القمم المرستيمية الجديدة وهكذا . ويؤدي استمرار هذه العملية لعدة مرات إلي تكوين كتلة من النموات الجديدة .
ثم يلي ذلك نقل هذه النموات إلي بيئة أخرى تختلف في مكوناتها الهرمونية حتى تتم عملية التجذير وبع تكوين الجذور تنقل هذه النباتات إلي أصص معقمة بحرص تام ويجب رعايتها تماماً حتي يتم نقلها إلي البيوت المحمية .
بعض التعريفات الهامة في مجال زراعة الأنسجة
1 - زراعة المتوك ( حبوب اللقاح ) والبويضات :-Pollen, Anther and ovule culture
الهدف منها الحصول علي نباتات أحادية المجموعة الكروموسومية يطلق عليها Haploid وهذه النباتات تفيد في المجالات التالية :-
1 - الحصول علي نباتات ثنائية المجموعة الكروموسومية نقية وثابتة وراثياً وذلك بمضاعفة النباتات ال Haploid باستخدام الكوليثيسن وهذا يوفر الوقت والجهد ( 12 عام علي الأقل ) المبذول في الطرق العادية .
2 - استعادة بعض النباتات الهجين التي بها نسبة من العقم الذكري لخصوبتها ( كما في بعض نباتات الأرز )
3 - تستخدم مزارع المتوك في إنتاج أصناف هجين من الهليون جميع نباتاتها مذكرة فقط .
4 - انتخاب الطفرات المنتخبة والتي تغطى بالجين السائد في النباتات الخلطية .
5 - يمكن عمل الخريطة الكروموسومية مباشرةً حيث يمثل النبات الأحادي جاميطة واحدة .
6 - إنتاج نباتات لها سيتوبلازم خاص وذلك بزراعة النباتات التي تحتوي علي سيتوبلازم .
2 - نباتات أحادية المجموعة الصبغية :- Haploid plants
تتميز بأنها ( 1n ) أي بها نصف العدد الكروموسومي ويتم الحصول عليها من زراعة المتوك أو حبوب اللقاح .
وتفيد هذه النباتات في مجال تربية النباتات حيث عن طريقها :-
1 - يتم الحصول علي نباتات خالية من الأمراض وخاصة الفيروسية .
2 - يتم الحصول علي نباتات ثنائية المجموعة الكروموسومية نقية وثابتة وراثياً .
3 - معلق الخلايا :- Cell suspension
وهو عبارة عن زراعة الخلايا المراد إجراء تجارب عليها في بيئة سائلة مما يسهل زراعة هذه الخلايا أو حقنها داخل أي كائن حي .
4 - Batch culture
يقصد به زراعة بعض الأجزاء النباتية في حجم ثابت في بيئة الزراعة .
5 - زراعة الكالوس :- Callus culture
الكالوس :- هو عبارة عن تجمع بروتوبلازمي من خلايا غير مميزة أو غير مشكلة ( أي توجد جذور وسيقان وأوراق ) ] غير منتظمة [ .
جة الإصابة للفيرس أو الأمراض .

مقدمة زراعة الانسجة 4

ظاهرة Habituation :-


هي تأثير مباشر لنمو الأجزاء النباتية المزروعة علي بيئة غذائية بها أحد الهرمونات ( مثل السيتوكاينينات ) حيث يحدث له تشبع وعند نقله هإلي بيئة جديدة ليس بها هذا الهرمون فإنه بنمو نمواً جيداً كما لو كان بالبيئة هذا الهرمون وتسمى هذه الظاهرة بظاهرة التعدد .وتسلك الأجزاء النباتية هذا السلوك في مرة واحدة فقط أما لو نقلت إلي بيئة أخرى مرة ثانية وكانت هذه البيئة خالية من الهرمون فإنها لا تسلك نفس السلوك السابق .
مثال :-
عند تنمية القطع الساقية للبطاطس في بيئة بها بنزيل آدينين يتكون بها جذور وعند تنمية الجذور في بيئة سائلة خالية من البنزيل آدينين فإن المناطق التي يحدث بها جرح تكون كالوس علي الجذور وتسمى هذه
مجالات زراعة الأنسجة
مزارع الخلايا Cell culture :-
تعتبر أول خطوة في عمل مزارع الخلايا هي عزل الخلايا المفردة وتتم عملية عزل الخلايا المفردة إما بالوسيلة الميكانيكية وإما أنزيمياً من الأعضاء النباتية وإما تؤخذ من نسيج كالوس نامي .
يلي هذه الخطوة زراعة الخلايا المفردة علي البيئة المناسبة , وتعد طريقة برجمان من اكثر الطرق شيوعاً في زراعة الخلايا المفردة ويراعي في هذه الطريقة أن يكون تركيز الخلايا المفردة في البيئة السائلة ضعف التركيز النهائي المطلوب عند الزراعة .
وتتوقف طبيعة النمو في مزارع الخلايا علي تركيز الهرمونات في بيئة النمو حيث انه قد يكون النمو متميز أي يتكون نموات خضرية أو جذرية أو كليهما أو قد يكون النمو غير متميز أي تتكون كتلة من الخلايا تسمي كالوس Callus .
وينتج الكالوس من أي نسيج نباتي متميز . بوضع الجزء النباتي الذي تؤخذ منه الخلايا في بيئة تحتوي علي تركيز مرتفع من الأوكسين وتركيز منخفض من السيتوكينين حيث يتكون الكالوس عند ذلك ويمكن أن يستمر في النمو إما علي صورة كتل متعددة الخلايا في البيئات الصلبة أو علي أشكال تجمعات صغيرة من الخلايا في البيئات السائلة .
ومع استعمال تركيز مرتفع من السيتوكينين ومنخفض من الأوكسين فأنه يمكن أن تتكون الجذور والسيقان والأوراق .
تكوين الأجنة الجسمية في مزارع الخلايا:-
يجب توفر شروط معينة لتكوين الأجنة الجسمية في مزارع الخلايا وهذه الشروط تتعلق بمنظمات النمو وخاصة السيتوكينينات , والأوكسينيات , ومصدر النيتروجين فمثلاً في مزارع الجذور تتكون الكالوس عندما تكون البيئة في الأوكسين وعند نقل هذه الخلايا إلي بيئة ذات تركيز منخفض أو خالية من الأوكسين فأنه تتميز الأجنة الكاملة .
أما مصدر النيتروجين في البيئة فيكون في صورة مختزلة مثل كلوريد أمونيوم أو نترات بوتاسيوم .وتكوين الأجنة يتطلب حد أدني من أيون الأمونيا داخل الخلايا ويتحقق ذلك بوجود تركيز منخفض من الامونيا أو تركيز مرتفع من النترات في البيئة ويجب توفير تركيز عالي من البوتاسيوم وألا يزيد الأكسجين الذائب عن 1.5مليجرام /لتر لأن التركيز العالي يشجع تكوين الجذور.
أهمية مزارع الخلايا أو الأنسجة في تربية النبات :-
يمكن الاستفادة من مزارع الأنسجة أو الخلايا في تربية النبات كالتالي :-
يمكن الحصول علي الاختلافات الوراثية التي يحتاج إليها المربي في برامج التربية من مزارع الأنسجة فمثلاً:-
-تعتبر مزارع الخلايا مصدراً هاماً للطفرات التي تعتبر أحد مصادر التصنيفات الوراثية وذلك لأن كل خلية لها القدرة علي أن تصبح فرد جديد وبالتالي احتمالات الحصول علي طفرات يكون كبير .
ولقد لوحظت هذه الطفرات في مزارع محاصيل الخس,الثوم,الأرز,غيرها.
2-يمكن عن طريق مزارع الأنسجة انتخاب نباتات مقاومة للأمراض والظروف البيئية الغير مناسبة فمثلاً:-
-أمكن انتخاب صنف طماطم يتحمل تركيزات مرتفعة من الملوحة كذلك أمكن انتخاب سلالات خلايا مقاومة للملوحة من مزارع الخلايا لعدة محاصيل مثل الفلفل , البرتقال , الأرز , القلقاس .
-كذلك أمكن إنتاج سلالات مقاومة للفيروس من نبات الدخان من مزارع الخلايا .
مزارع المتوك Anther culture
تفيد مزارع المتوك في إنتاج نباتات أحادية Haploid من حبوب اللقاح إما من خلال تكوين أجنة أو من خلال تكوين الكالوس .
ما يراعى عند عمل مزارع المتوك :-
1 - يجب أن تؤخذ المتوك من نباتات حديثة الإزهار ويكون ذلك في مرحلة معينة من تكوين حبوب اللقاح قبل تفتح الزهرة .
لذلك يفضل زراعة النباتات التي تؤخذ منها المتوك في ظروف متحكم فيها بيئياً ليمكن الربط بين المظهر الخارجي للبرعم الزهري والمرحلة المناسبة لتكوين حبوب اللقاح .
2 - يجب تطهير البراعم الزهرية المنتخبة بأحد المطهرات المناسبة ثم تفصل الأسدية كاملة ( متك + خيط ) وتوضع في طبق بتري معقم .
3 - يجب ان تسحق أحد المتوك في صبغة أسيتوكارمن لإختبار مرحلة تكوينه فإذا كانت المرحلة مناسبة تفصل بقية المتوك عن الخيوط وتوضع أفقياً في بيئات زراعية .
4 - يجب الحذر والحرص عند فصل وزراعة المتوك حتى لا تحدث أضراراً لها حيث أن تجريحها يؤدي إلي تحفيز تكوين كالوس من خلال جدر المتوك وهي خلايا ثنائية .
5- يجب تحصين مزارع المتوك من الضوء لمدة 12 - 18 ساعة وعلي درجة حرارة 28 ْ م بالتبادل مع فترة ظلام مدتها 6 - 12 ساعة علي درجة حرارة 22 ْ م , بعد 3 - 8 أسابيع يبدأ تفتح المتوك وتحولها إلي اللون البني وذلك بسبب ضغط الكالوس المتكون من حبوب اللقاح علي المتوك أو بسبب النباتات الصغيرة التي تنمو فيها .
6- تفصل النباتات المفردة أو النموات الخضرية المتكونة من الكالوس بعد أن يصل 3 - 5 سم وتنقل إلي بيئة مناسبة لتكوين الجذور ثم بعد ذلك تنقل النباتات التي تكونت جذورها إلي أصص صغيرة معقمة .
أهمية مزارع المتوك وحبوب اللقاح :-
1 - ترجع أهمية هذه المزارع إلي الحصول علي نباتات أحادية المجموعة الكروموسومية إما من خلال تكوين الأجنة أو تكوين الكالوس ويفيد ذلك في الآتي :-
أ - تستخدم النباتات الأحادية في الحصول علي نباتات ثنائية أصيلة من المحاصيل الخلطية التلقيح وذلك بمعاملتها بالكوليثيشين .
وذلك يوفر من 6 - 8 أجيال للتربية الذاتية .
ب - تفيد النباتات الأحادية في الحصول علي مختلف حالات التعدد الكروموسومي الغير تام .
2 - تفيد مزارع المتوك في التعرف علي الطفرات المنتخبة بسهولة .
3 - استخدمت وزارع المتوك في إنتاج أصناف محسنة لبعض المحاصيل في وقت قياسي مثل القمح - الأرز - الشعير .
4 - إنتاج أصناف هجين من الهليون جميع نباتاتها مذكرة .
مزارع الأندوسبرم Endosperm culture :-
تفيد مزارع الأندوسبرم في إنتاج نباتات ثلاثية المجموعة الكروموسومية حيث أن الأندوسبرم نسيج ثلاثي 3n ينتج من اندماج إحدى الخليتين التناسليتين لحبة اللقاح مع نواتا الكيس الجنيني . ويتم الحصول علي النباتات الثلاثية عن طريق تكوين براعم من الأندوسبرم مباشرةُ أو عن طريق الكالوس . ويجب ملاحظة أن الأندوسبرم الكامل النمو لا يصلح للزراعة لذلك يجب مراعاة عزل الأندوسبرم بعد مدة معينة من التلقيح وهي تختلف من نوع إلي لآخر فمثلاً في الذرة 8 - 11 يوم وفي الأرز من 4 - 7 يوم . ومن النباتات التي تنجح فيها زراعة الأندوسبرم البقدونس - الأرز - الكمثرى .
التلقيح في مزارع المبايض والبويضات :-
يستخدم مصطلح in vitro pollination في جميع الحالات التي توضع فيها حبوب اللقاح مباشرة علي البويضات المفصولة في بيئة صناعية أو علي مياسم الأزهار التي فصلت ووضعت في بيئة صناعية أو علي البويضات التي فصلت من مشيمتها في بيئة صناعية .
تعريف مزارع البويضات :-
هي المزارع التي يتم فيها زراعة البويضات منفصلة أو نزع البويضات من المشيمة في بيئة صناعية Ovule culture .
مزارع المبايض :-
هي الخالة التي يتم فيها زراعة المياسم الأزهار في بيئة صناعية Ovule culture .
يتم خص الأمهات قبل تفتح الأزهار بيومين ثم تكيس وتجمع الأزهار المخصية بعد تفتحها بيوم أو اثنين حيث يزال الكأس والتويج ويغمس المتاع في كحول 70 % لمدة ثواني ثم يغسل جيداً بالماء المقطر ثم يزال الميسم والقلم وجدار المبيض وبذلك تبقي المشيمة والبويضات وقد تزرع البويضات الاثنتان معاً في حالة مزارع المبايض يزرع الميسم كاملاً .
يتم جمع متوك غير متفتحة من الآباء وتحفظ في طبق تيري معقم إلي أن تتفتح حيث تنقل حبوب اللقاح بحرص وتوضع علي البويضات المزروعة او علي المياسم أو المشيمة .
ويكون الهدف من هذه المزارع الحصول علي بذور مكتملة التكوين ونجحت هذه الطريقة مع الطماطم - الفاصوليا - الشليك .
أهمية مزارع المبايض والبويضات :-
1 - إنتاج نباتات أحادية من خلال التوالد الذاتي .
2 - يتم التغلب علي حالات عدم التوافق الذاتي والخلطي في مزارع البويضات حيث يتم إزالة أنسجة المبيض الأمية المسؤلة عن عدم التوافق .
3 - التغلب علي مشاكل العقم في بعض الهجن النوعية البعيدة .
4 - الحصول علي بذور مكتملة التكوين .

مقدمة زراعة الانسجة 3




تجهيز معمل زراعة الأنسجة :-
يجب توفير الأجهزة التالية في معمل زراعة الأنسجة :-
1 - جهاز تقطير الماء :-
الماء المستخدم في زراعة الأنسجة لابد أن يكون مقطر مرتين Double destile water ويمكن الحصول عليه من جهاز تقطير الماء مرتين وقوته 200.000 أوم / ساعة .
شروط الماء المستخدم في زراعة الأنسجة :-
1 - خالي من الشوائب حتى لا يحدث تلوث للبيئة .
2 - خالي من الأملاح المعدنية حتى لا يؤدي ذلك لتغير pH البيئة وبالتالي تصبح سامة للنبات .
3 - أن يكون الماء مقطر مرتين D.D.W .
وعن طريق جهاز وهو عبارة عن عمود من الراتنجات به شحنة موجبة وأخرى سالبة وذلك لجذب الأملاح الموجودة في الماء وبالتالي تقطيره أو عن طريق الأسموزية وهو عبارة عن غشاء يوضع بداخل أسطوانة يوجد بخارجها تركيز عالي وبداخلها تركيز منخفض فيتم بذلك الاتحاد مع الأملاح التي توجد بالماء وبالتالي تقطيره .
وتعد الطريقة الأولي أكثر الطرق استخداماً وأفضلها .
ملحوظة :-
يمكن استخدام ماء الأمطار في زراعة الأنسجة .
2 - الميزان :-
يجب توفير ميزان بمعمل زراعة الأنسجة وأن تكون حساسية الميزان
2 -5 مليجرام ويزن حتى 50 جرام أي حساسية الميزان حتي الرقم العشري الثالث .
3 - جهاز لضبط ال pH :- pH Meter :-
حيث انه لابد أن يكون pH البيئة المستخدمة يتراوح من 5.5 - 5.8 ويجب أن تكون حساسية الجهاز 1.4 P.P.m
ويستخدم لضبط pH البيئة محلول Hcl مخفف ( 1ع ) لخفض ال pH عندما يكون الوسط قلوي .
ويضاف KOH لرفع ال PH عندما يكون الوسط حامضي .
ملحوظة :-
تستخدم KOH بدلاً من NaOH حتى يستفيد النبات من عنصر البوتاسيوم كما أنه عنصر غير سام بالنسبة للنبات .
4 - جهاز سخان ومقلب :-
يستخدم السخان لتسيح أو لانصهار الآجار في حالة البيئات الصلبة حتى يسهل صبه ويستخدم المقلب في إذابة المحاليل وهو عبارة عن مغناطيس يمكن استخدامه أيضاً في تقليب الآجار حتى لا يلتصق ويأخذ اللون الأسود , وكذلك في إذابة المحاليل والكيماويات ويستخدم أيضاً في تقليل التلوث الموجود علي الأجزاء النباتية .
5- أجهزة تنظيف الأجزاء النباتية :-
تتم عملية تنظيف الأجزاء النباتية بإحدى الطرق التالية :-
أ - وضع الأجزاء النباتية في كأس وتغطيته بشاش أو سلك وفتح الصنبور عليه .
ب - عن طريق استخدام المقلب .
جـ - عن طريق إحداث موجات فوق صوتية تحدث ذبذبات شديدة الأجزاء النباتية وبالتالي تنظيفها .
د - عن طريق غمس الأجزاء النباتية في الكحول 95 % لمدة ثواني ثم وضعها في محلول كلوراكس 15 % لمدة 15 دقيقة وبعد ذلك توضع في ماء مقطر ثلاث مرات للتخلص من أثر الكلوراكس .
6- أجهزة صب البيئة :-
تستخدم هذه الأجهزة في صب البيئة في أطباق بتري أو الزجاجات التي يتم الزراعة فيها وتختلف هذه الأجهزة عن بعضها ويوجد منها عدة أشكال :-
أ - أحد هذه الأجهزة عبارة عن حقنة زجاجية كبيرة مدرجة تنتهي هذه الحقنة بخرطومين أحدهما لشفط البيئة والأخرى لصبها في الأطباق وذلك علي حسب الحجم المطلوب .
ب - يوجد جهاز كهربائي لصب البيئة وهو ينتهي أيضاً بخرطومين أحدهما لشفط البيئة والآخر لصبها في الأطباق ويتم التحكم في الحجم المطلوب وجوده ميكانيكياً .
7- أجهزة تعقيم البيئة :-
يتم تعقيم البيئة في الأوتوكلاف علي درجة حرارة 121 ْ م وتحت ضغط جوي 15 ض. ج 15 Psi لمدة 15 دقيقة .
8- الهزاز الدائري :-
يستخدم الهزاز الدائري في الاستعمالات التالية :-
أ - الزراعة المائية مثل زراعة الجذور والأقراص الورقية .
ب - فصل الخلايا من الكالوس بوضعه في محلول مائي .
جـ - زراعة الخلايا علي الميكروفيلم في البيئة المائية .
يستخدم هذا الجهاز في حدود 100 R . B .Y
9 - آلة غسيل الأدوات :- Dishwasher :-
يتم فيها غسيل معظم الأدوات الزجاجية مثل أطباق يتري , الماصات , المخابير , الزجاجات , وغيرها من الأدوات الزجاجية المعدنية .
ويستعمل في الغسيل ماء مقطر مرتين ولا يستخدم الصابون مطلقاً .
10 - الثلاجة :-
وتستخدم الثلاجة في تخزين البيئات , الكيماويات , المحاليل المغذية , ويفضل وجود حجرة كاملة للتخزين .
11 - ميكروسكوب :- Microscope :-
وهو يستخدم في حالات نادرة مثل انصهار البروتوبلاست ويستخدم أيضاً لفحص الخلايا والأنسجة .
12 - الهود :- Transfer Hood :-
وهو المكان التي تتم فيه زراعة الأجزاء النباتية ويجب أن يكون معقم 100% .
13 - الأرفف :- Shelves :-
يستخدم الأرفف في وضع الأدوات عليها مثل الأدوات الزجاجية والمعدنية .
14 - فرن :-
وذلك لتجفيف الأوعية والزجاجات وتعقيمها علي درجة 200 ْ م
لمدة 4 -24 ساعة .
15 - الأدوات الزجاجية والمعدنية :-
دوارق مخروطية بأحجام مختلفة
دوارق معيارية بأحجام مختلفة
مخابير مدرجة بأحجام مختلفة
ماصات مدرجة بأحجام مختلفة
أطباق بتري , وزجاجات بأحجام مختلفة للزراعة فيها .
ملاقط كبيرة ذات أطراف غير حادة للزراعة .
ملاقط ذات أطراف حادة لنزع بشرة الأوراق .
ابر تشريح .
ما هي الإرشادات الهامة التي يجب مراعاتها في معمل زراعة الأنسجة :-
هناك بعض الأمور الهامة التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند المعمل في مجال زراعة الأنسجة :-
1 - يجب عدم تقريب الكحول من اللهب لأنه سريع الاشتعال .
2 - يجب عدم استنشاق هيبوكلوريد الصوديوم لأنه سام جداً .
3 - يحظر عدم إطالة النظر إلي لمبة Ultraviolet لأنها تسبب العمى .
4 - الاحتراس عند التعقيم بمحلول السليماني لأنه شديد السمية .
يجب الاحتراس عند استعمال الكيماويات لأنها شديدة السمية .
ينصح بغسيل الأسطح غسيلاً جيداً بالكحول 70 % أكثر من مرة وذلك لتقليل التلوث .
بنصح بأن تكون الملابس التي يرتديها من يقوم بالزراعة نظيفة لتقليل التلوث .
يجب تعقيم المعمل كله تعقيماً جيداً لضمان خلوه من الميكمروبات قبل بدء العمل .
تعقيم الأدوات المعدنية بالكحول وتعريضها للهب حتى الاحمرار لتقليل أي ميكروبات توجد عليها .
تعقيم الهود جيداً قبل الزراعة .
أن يكون الماء المستعمل في زراعة الأنسجة مقطر مرتين ومعقم حتى نضمن خلوه من الميكروبات والأملاح .
تعقيم الأيدي باستمرار أثناء الزراعة لضمان التعقيم التام .
ينصح باختبار الهود قبل الزراعة فيه للتأكد من خلوه من التلوث .
التأكد من التعقيم التام لأدوات الزراعة والبيئات والأجزاء النباتية المستخدمة في الزراعة لضمان نجاح العمل .
بنصح بعدم التحدث أثناء الزراعة تجنباً للتلوث .
ينصح بعد إمرار الأيدي فوق مكان الزراعة تجنباً للتلوث .
كيفية اختبار التلوث الموجود في الهود :-
لمعرفة مدى نظافة الهود وملاءمته للزراعة به نضع بداخله عدد من أطباق تيري بكل منها بيئة مغذية وتوزع الأطباق في أماكن مختلفة من الهود ونتركها لفترة معينة ثم نكشف عنها لمعرفة وتقدير مدي تلوث البيئات بكل طريق .